Em julho de 1999, a Rede Globo assinava um contrato com os herdeiros de Monteiro Lobato, para produzir uma nova adaptação para a televisão, baseada na coleção de histórias do Sítio do Picapau Amarelo. Essa nova versão, a segunda da rede Globo, estreou no dia 12 de outubro de 2001, às 11h30, dentro do programa infantil Bambuluá, em edição especial para o Dia das Crianças

A previsão inicial para a reestreia da atração era 15 de outubro, porém havia uma preocupação muito grande por parte da emissora, de que o projeto iniciado há um ano e meio, seria tão bom quanto a edição anterior, exibida com estrondoso sucesso entre 1977 e 1986.

A ideia então foi iniciar a exibição do Sítio do Pica-Pau Amarelo como uma das atrações do programa comandado pela apresentadora Angélica, em episódios de apenas 15 minutos, levados ao ar de segunda à sexta-feira. Nessa primeira fase, a história de um dos livros da série literária escrita por Lobato era dividida em apenas 5 episódios.

Mantendo a tradição, a produção dessa segunda versão do Sítio do Pica-Pau Amarelo na TV Globo contou com uma equipe de produção de peso, com nome como Roberto Talma (2001) e Carlos Manga (2006) na direção de núcleo; Luciana Sandroni, Mariana Mesquita, Cláudio Lobato e Toni Brandão na redação e adaptação; Márcio Trigo (2001); Cininha de Paula e Paulo Ghelli (2002); Carlos Magalhães (2007) na direção geral.

De acordo com Roberto Talma, toda equipe de produção não se preocupava apenas com a audiência da nova atração, mas também com a necessidade da adaptação da famosa obra de Lobato para os dias atuais, sem descaracterizar o original. E assim como na primeira versão, a equipe da nova produção se manteve o mais fiel possível à obra do autor e conseguiu de forma brilhante, aproximar o programa da vida atual, mantendo o aspecto rural presente no original Lobatiano, sem abrir mão de fazer a conexão com as crianças dos grandes centros urbanos.

Entre as inovações apresentadas nessa segunda versão, destaque para a “modernização” do cenário do Sítio, localizado agora na ilha de Guaratiba, no Rio de Janeiro, que contava por exemplo com um computador com acesso à internet e forno microondas. A linguagem dos personagens também foi adaptada de modo a se aproximar da realidade atual sem perder a sua essência, misturando gírias recentes – como “maneiro” e “sinistro” – com expressões usadas na obra de Lobato, como “cara de coruja seca” e “torneirinha de asneiras”.

Para dar vida aos personagens principais, o elenco do Sítio do Pica-Pau Amarelo de 2001 contou com as atrizes Nicette Bruno no papel de Dona Benta, Dhu Morais (ex-integrante do grupo musical As Frenéticas) como Tia Nastácia, e com o ator Cândido Damm na pele do Visconde de Sabugosa.

Entretanto o grande destaque ficou por conta dos personagens infantis: a boneca de pano Emília por exemplo, foi interpretada pela primeira vez por uma criança, a atriz Isabelle Drummond, na época com apenas 7 anos de idade. Anteriormente, em uma adaptação de cinema, também houve uma pequena menina chamada Olga Maria, que interpretou a Emília no filme ‘O Saci’, de 1951, ainda em preto e branco, dirigido por Rodolfo Nani e baseado no livro homônimo, escrito por Monteiro Lobato. Com exceção desse filme, e dessa nova versão do Sítio na Globo, a boneca Emília havia sido interpretada unicamente por atrizes adultas.

Outros destaques infantis foram as atuações da menina Lara Rodrigues no papel de Narizinho, de César Cardadeiro que viveu Pedrinho e o garoto Izak Dahora que deu vida ao nosso Saci Pererê. Esse atores viveram nessa versão do Sítio o seu primeiro grande papel na TV.

O elenco dessa segunda versão, contou ainda com as participações de Jacira Santos como a bruxa Cuca; o amado João Acaiabe como Tio Barnabé; Aline Mendonça vivendo o Marquês de Rabicó); Zé Clayton que deu vida ao Burro Falante e Sidnei Beckencamp como Quindim, além da participação especial de Ary Fontoura vivendo o Coronel Teodorico.

Na área musical mais algumas novidades. A canção original, de Gilberto Gil, foi mantida e passou a conviver com uma nova trilha sonora interpretada por Ivete Sangalo, Carlinhos Brown, os mineiros do Jota Quest e Cássia Eller, que interpretou a música-tema da vilã Cuca.

Com bons índices de audiência, o programa mais uma vez caiu nas graças dos brasileiros, comprovando que os personagens do imaginário Lobatiano continuavam conquistando novas gerações com histórias empolgantes, atuações convincentes e uma excelente produção.

Diante do grande sucesso, a emissora se viu estimulada por seus telespectadores a lançar uma linha de produtos especiais com os personagens do Sítio, como vídeos e DVDs com episódios lançados no natal de 2001, além de bonecas, mochilas, cadernos, álbum de figurinhas, entre outros produtos. Ainda em dezembro daquele ano, a Globo exibiu um especial musical intitulado ‘A Festa da Cuca’, que teve a participação de todos os artistas da nova trilha sonora e de atores convidados, como Malu Mader no papel da Cuca.

A partir do dia 22 de dezembro daquele ano, a segunda versão do Sítio do Pica-Pau Amarelo na Globo, deixou o programa da Angélica e conquistou o seu próprio espaço, sendo exibido de segunda a sexta feira, as 11h30 e depois as 10h10, até 2007.

Essa segunda versão do Sítio na Globo teve um total de sete temporadas exibidas entre os anos de 2001 a 2007.